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[生财有道]扎根云南的玛咖财富(20130206)
玛咖是一种原产于南美洲秘鲁安第斯山区的高原植物，长久以来一直是生活在安第斯山区印加人的主要食物之一。玛咖在南美洲有上千年历史，被当地人称之为“安第斯人参”。云南的马清经过三年时间种植的玛咖已经占全球份额60%、全国份额80%的原料生产能力，成为国内唯一全产业链运作玛咖产业的企业。
玛咖(英文名：maca，Peruvianginseng)
【来源】为十字花科植物玛咖LepidiummeyeniiWalpere的块根。
【植物或药材性状】一年生或两年生草本，高12—20cm。具块根，直径2—5cm，似萝卜状，表面大多黄色或紫色，肉质白色，具有刺激性气味。叶条形，长10～20cm，叶片呈玫瑰花形排列。总状花序顶生，花小。果实短筒状，内含一种子。
【产地】玛咖原产于秘鲁安第斯山区海拔3500～4500m。现主要分布于中部puro生态区。是一种食、药两用植物。
【传统使用】传统上用于增强精力，抗疲劳，改善性功能，提高生育力，治疗女性更年期综合征等。玛咖得到人们重视是上世纪90年代初，研究寻找“伟哥”替代药物，发现了这种植物在提高性功能上的显著功效。对玛咖成分、药理作用等做了大量工作。
【主要化学成分】从根中得到玛咖酰胺和玛咖烯，含量可达到0．6％；从新鲜根中得芥子油苷约为1％，异硫氰酸苄酯在干燥根中含量为0．10％～0．15％；甾醇及其衍生物，甾醇往往以苷或乙酸酯形式存在，在干根中的含量可达0．03％～0．04％；分出4种生物碱，其结构至今未见报道。玛咖中的营养成分丰富。
首播时间：周一至周五 18:43
[每日农经]江南古镇边的凶猛鳄鱼餐(20120329)
徐主任：小李，怎么样？烟花三月的江南不一般吧。
李含晔：太不一般了，我要好好品尝才行。
可让记者小李没想到的是，在离千灯古镇不到5分钟车程地方，竟有藏獒看守、立起四米铁网，戒备森严，这里面究竟藏了什么宝贝？
李含晔：这气氛怎么紧张兮兮的，我怎么觉得四处老有眼睛在盯着我……
徐主任：那就对了，大鳄朋友就在你身后。
李含晔：啊？…鳄鱼呀。还这么多。
徐主任：这一间不算多了，小李，你知道吗，你现在处于鳄鱼谷中心。四周埋伏了2万多条鳄鱼，最大的4米长呢。你注意安全啊。
鳄鱼听上去带个鱼字，但实际上，是迄今发现活着的最早和最原始的爬行类脊椎动物，已存在两亿三千多年了。它们性情凶猛，成年鳄的咬合力达到1000公斤以上，能瞬间咬死猎物。目前全世界有23种鳄鱼，眼前的这些大鳄叫暹罗鳄，原产于东南亚的泰国。
程总：姑娘，你怎么了？
李含晔：大哥你好
程总：你就是小徐说的那位来参观的农业记者吧，别楞这，走我带你进去……
李含晔：啊，进去……
小李，你别怕，他可是当地鼎鼎有名的鳄鱼养殖达人？--陈冬春，养鳄9年，鳄鱼已从最初的一两百条发展到如今的2万条。其间虽艰辛不易，不过，这些凶猛的鳄鱼却为他带来了年利润过千万的财富。现在鳄鱼的栖息之所也被称为鳄鱼谷，成为当地的旅游新亮点。
李含晔：我还是躲在你后面吧，万一张开血盆大口，咬我一口怎么办。
陈总：它咬是会咬的，但是不是血盆大口。
陈总：我来给你看一下。
李含晔：它怎么没有舌头？
陈总：全世界23种鳄鱼，都没有舌头的。它是靠吞咽的。14:40李含晔：我看它刚才嘴一转过来，怎么没有嗓子眼啊？
陈总：它里面有一个闭合塞，
陈冬春养殖的泰国暹罗鳄，属于二级野生保护动物，养殖户在满足一定的条件后是可以饲养的。暹罗鳄繁殖能力强、生长快、抗病力强、皮质优良。在这个400平米的大棚里，按3比1的雌雄比例，养殖了200多条种鳄呢。
员工：我们人工养殖的鳄鱼，性成熟是8岁，每年可以繁殖一次，一次是20到75枚之间，繁殖到40岁左右，就停止繁殖。
这些大棚里面都是不同阶段的鳄鱼苗，每一个棚里都有四五千条，养殖密度一平方？条。雾气特别大。
温度是保证幼鳄健康成长的关键，必须在30到35摄氏度之间，所以不仅大棚上覆盖了厚厚的胶皮，就是门帘都加了层棉被保温，生怕温度降低。小鳄鱼只要平安度过幼龄阶段，成年后它们的生存和抗病能力可是相当强的。
员工：大鳄鱼我们很好处理。关键是小鳄鱼。它在幼鳄期间很特殊。鳄鱼绝大部分的死亡，都会在幼鳄期间。
员工：小鱼，配合维生素C，差不多10个月左右，就很稳定了。
在温室里生长的小鳄鱼，得到了工作人员精心的呵护，他们每天都会根据小鳄鱼体重的2%来喂饲料，您看这些退了毛的小鸡仔就是小鳄鱼们最爱的营养美餐了。成本大约每公斤3元钱。
李含晔：大哥，像这样子的一条小鳄鱼大概有多重？
员工：你自己拎一下看看吗。
李含晔：吓唬我呢，大鳄鱼我不敢，小鳄鱼我还怕？
李含晔：这鳄鱼要是没有牙就好了。……那我怎么拿起来？我这是在不好下手。
员工：鳄鱼一生要换3600颗牙齿。
牙齿是鳄鱼的“武器”，保持它的锋利和坚固很重要，因此旧牙会定期脱落长出新牙。小李，你是否后悔夸下了海口呢。
员工：现抓头，后抓尾巴。
李含晔：您看我这抓的是一条真的小鳄鱼，你看这个嘴，其实它在和我叫着劲呢，我如果不使劲抓着它的脖子话，它可能真的会咬伤我。像这么大的小鳄鱼大概有三四斤重。大哥想这个鳄鱼有多大岁数了？才8个月，如果鳄鱼一岁的话有多长多重？
解说：小鳄鱼的生长速度很快，每半年，体重和长度就能翻一倍多。成年以后它的生长速度渐缓。像这种泰国暹罗鳄最多能活150年，最长可长到4米，体重达一吨。
它基本上就是怕冷不怕热。它的温度在30到35度的话，它每天基本都要进食。你假如温度在22度的话，进食量差不多两三天一次……删：我们这个里面的鳄鱼差不多两天喂一次，因为是种鳄，我们要加强营养。
在野外，一条成年的鳄鱼可以坚持6年不进食；在鳄鱼谷里，人工饲养的鳄鱼主要以喂食鱼肉和鸡肉。只要吃饱了，一般情况都不会轻易攻击人。眼前这些都是昨天刚喂过的，所以陈冬春才敢带记者小李近距离观看。
工人：一般的情况下，按体重来算，100斤体重，能吃一斤的样子。
您看这鳄鱼张大嘴的样子，别误会是在要食吃。饲养员说，恰恰相反，它们已经吃饱了！鳄鱼是冷血动物，皮肤不能散发和吸收热量，它们张开大嘴就是为了吸收热量，加速食物消化。
DOI牶牨牥牣牨牫牰牨牥牤j牣cnki牣牨牰牱牪牠牫牭牪x牣牪牥牥牭牣牥牨牣牥牪牥
安徽农业大学学报,2005,32(1):81～86
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
4种破碎方法对古尼虫草内含物提取的初步研究
钟 石,蔡守平,胡丰林,樊美珍,李增智,耿德贵
(安徽农业大学微生物防治省重点实验室,合肥230036)*①
摘 要:以不溶固形物含量、腺嘌呤含量为指标比较了微波法、酶解法、自溶法和酸热法对交织顶孢霉菌丝
体中内含物提取率的差异。结果表明,浓度为0.1%的纤维素酶在50℃条件下处理样品3h破壁效果最佳,能较
好地使细胞内含物包括核苷类物质溶出,其次是微波法。由于纤维素酶的价格较高,不利于大规模工业化生产,
从经济角度考虑选用微波低温解冻档处理4min的细胞破碎方法来提取菌丝体中内含物较理想。
关键词:古尼虫草;细胞破碎;酶解法;微波法;自溶法;酸热法
中图分类号:Q949.32文献标识码:A文章编号:1672-352X(2005)01-0081-06
古尼虫草(Cordycepsgunnii(Berk)Berk)是寄生于蝙蝠蛾幼虫的一种虫草,具有相当的药用价值,对小鼠巨噬细胞吞噬功能有促进作用,并在抗常压缺氧、抗心律失常、促进记忆、诱生干扰素、平喘祛痰、增强人体免疫力、促进睡眠、镇痛[1～8]等方面具有重要的功效。古尼虫草及其无性型古尼拟青霉含有多种生物活性物质,如多糖、甘露醇、虫草素、核苷类物质、甾醇等。
前期的药理实验证明,古尼虫草小孢变种分离得到的交织顶孢霉(Acremoniumimplicatum(Miller,etal.)Gams),其水提物对大鼠实验性肝缺血再灌注损伤模型(IR)有明显的保肝作用。目前普遍认为核苷类物质具有保肝作用,而核苷类物质主要存在细胞内为胞内产物,如何将其尽可能提取出来是目前需要解决的一个关键性问题。细胞破碎的目的就是释放出细胞内含物,其方法很多,破碎方法的得当与否,直接影响到所提取的产品的产量、质量和成本。就细胞破碎的方法而言可分为机械法和非机械法,机械法包括珠磨法、高压匀浆法、超声波法和微波法等;非机械法包括溶酶法、酸热法和自溶法等[9,10]。本实验的目的就是通过对几种不同细胞破碎方法的比较,筛选出既能较好地提取菌丝细胞内含物,同时又适于工业化生产的低成本、快速安全等要求的方法,为以后古尼虫草代谢产物工业化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 分离自古尼虫草小孢变种的交织顶孢霉(A.implicatum(Miller,etal.)Gams,AI01)。
1.1.2 试剂 纤维素酶(cellulase“Onozuka”R-10):10000活力单位,YakultofJapan;核苷标样为Sigma公司产品;其余均为化学纯或色谱纯。
1.1.3 仪器 Gland微波炉、高速冷冻离心机、DGF30/14-Ⅱ电热鼓风干燥箱、美国ID凝胶成像分析软件、韩国YounglinHPLC及Autochro-20001.0工作站等。
1.2 方法
1.2.1 细胞破碎方法的筛选 (1)腺嘌呤标准曲线的制作:把腺嘌呤的标准样品配制成1mg mL浓度,在GF254高效硅胶板上点样,点样线距板底1.5cm,样品间距1cm。点样量分别为1μL、2μL、3μL、4μL和5μL。置于展开缸内(流动相为氯仿∶乙酸乙脂∶异丙醇∶水=7∶2∶8∶0.5,氨水1%)室温展开,待展开剂前沿走至高效硅胶板上端1cm处取出晾干。在波长为254nm的紫外灯下照相,并用ID凝胶成像
收稿日期:2004-02-25
基金项目:安徽省微生物防治重点实验室基金项目(2004A010)资助。-女,;(-),,,。*Correspondinghor)-1①
82安徽农业大学学报2005年分析软件分析,记录AvgOD值,以AvgOD和点样量制作标准曲线。
(2)核苷标样的HPLC:将核苷标样用甲醇溶解,10000r min离心后进高效液相色谱(highperfor-menceliquidchromatography,简称HPLC)分析。HPLC进样量为20μL,洗脱剂10%乙腈,流量1mL min,洗脱时间30min,波长260nm。
1.2.2 不同细胞破碎方法的处理 (1)微波法:将从发酵罐(70L,装液量50L,25℃培养6d)倒出来的成熟菌丝体直接进行细胞破碎试验(以下几种细胞破碎方法的样品均来源于同一批发酵液),取20mL菌液装入50mL三角瓶,在微波炉中将温度调至低温解冻档,分别处理2min、4min、6min、8min、10min和12min,每1min用流水冷却1次,每个处理3个重复,处理后抽滤,得不溶固形物,烘干称重;同时取滤液1mL加入等量的无水乙醇醇沉过夜,10000r min离心10min,将处理后的样品进HPLC柱,条件相同。
(2)酶解法:取20mL菌液装入50mL三角瓶,加入纤维素酶,使其菌液中纤维素酶的终浓度达到
-10.1%,于50℃、160r min振摇下酶解1h、2h、3h、4h和5h,每个处理3个重复,处理后测定方法同
上。
(3)自溶法:取20mL菌液装入50mL三角瓶,加入NaCl,使得菌液中NaCl终浓度分别为3mol
-1L,于55℃、160r min振摇下自溶4h、8h、12h、16h、20h和24h,每个处理3个重复,处理后测定方-1-1-1-1
法同上。
(4)酸热法:取20mL菌液装入50mL三角瓶,加入浓盐酸,使得菌液内盐酸终浓度为3mol L,于沸水浴分别放置10min、20min、30min、40min和50min,每个处理3个重复,处理后测定方法同上。-12 结果与分析
2.1 检测指标的确定
2.1.1 腺嘌呤含量的标准曲线 药理实验证明古尼虫草的代谢产物中核苷类物质具有药理作用。由于虫草菌丝体中含有多种核苷类物质,每种检测都较为不便,同时经TLC检测其中腺嘌呤含量较高,故本研究仅以腺嘌呤为指标来检测,同时检测不溶固形物以全面评价不同破碎方法的效果,为以后代谢产物发酵条件的研究提供理论依据。
2标准曲线为y=4100x+154.9,R=0.9959。因为R=
0.9979>R0.01,说明该标准曲线的可靠性好,可用于后面的
定量分析。
2.1.2 核苷标准样品的HPLC HPLC是在原有的液相柱层
析基础上引入气相色谱的理论并加以改进和发展起来的,兼
具分离效能高、选择性好、检测灵敏度高和分析速度快的特
点,因此应用范围也日益扩展。进行分析时,HPLC是根据不
同物质在柱体中保留时间不同,从而达到分离纯化的效果。
一般情况下,图谱上有几个峰就表示样品中含有几种物质,
峰面积的大小代表样品中物质的含量不同。核苷标样的
HPLC如下图2所示。
2.2 不同细胞破碎方法的效果图1 腺嘌呤含量的标准曲线Figure1 Thestandardcurvesofadenine4
2.2.1 微波破壁效果 进行微波处理时,主要通过改变微波强度和处理时间来设计试验条件。实验中,在设置不同的温度档进行细胞破壁实验时发现在微波处理不到1min菌液就产生沸腾现象致使菌液外溢,故选用低温解冻档并采取间歇处理,每处理1min后用流水冷却1次。
从图3中不难看出,随着处理时间的延长,不溶固形物的含量逐渐减少,而胞内产物腺嘌呤的含量逐渐增加;同时还可以看出处理4min后腺嘌呤的含量上升幅度逐渐减小,处理4min与处理8min腺嘌呤的含量相差不大,这说明微波处理4min已经可以较完全地将细胞内含有的核苷类物质提取出来,因为微波加热导致细胞内的极性物质,尤其是水分子吸收微波能,产生大量的热量,使胞内温度迅速上升,细胞质膨胀及液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞;进一步加热,导致细胞内部和细,,,
32卷1期钟 石等 4种破碎方法对古尼虫草内含物提取的初步研究83内产物[11]。将经微波处理、醇沉去除蛋
白质和多糖的样品过HPLC分析柱(图
4),结果显示有7个峰,说明微波处理后
的溶液中主要含有7种物质,其保留时
间分别为2.0500、2.7500、3.2000、
5.2833、5.8167、6.8833和8.0833,与核
苷类标样的保留时间相对照,它们可能
分别为尿苷、黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶核
苷、腺嘌呤、黄嘌呤和腺苷等物质。从峰
面积来看,核苷类物质的总含量也很多,1.尿苷Uridine,2.黄嘌呤核苷Xanthosine,3.胸腺嘧啶核苷Thymidine,4.峰面积达51334.458。这可能是因为微腺嘌呤Adenine,5.黄嘌呤Xanthine,6.腺苷Adenosine,7.虫草素波处理的条件比较温和,既可以将菌丝Cordycepin
体中的核苷类物质释放出来,又不破坏
其化学结构。总之,无论从腺嘌呤含量,图2 核苷标样的HPLCFigure2 HPLCofstandardsampleofnucleotides
还是HPLC结果来看,该法提取的物质种类及含量均较多
。
2.2.2 酶解法破壁效果 酶解法是一种研究较广的方法,它利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键,从而达到破壁的目的 。虫草菌细胞壁的结构及其组成成分还不十分清楚,一般而言,真菌细胞壁的成分中应包括蛋白质、几丁质和纤维素等。而其中纤维素在虫草菌细胞壁中含量较高,在细胞壁结构中起重要作用。纤维素酶是一种复合酶,由C1酶、Cx酶和纤维二糖酶共同组成。3种酶的最适作用温度均为50℃,对纤维素的降解作用是通过这3种酶的共同作用完成的
下对交织顶孢霉菌丝体进行破壁处理
。[13][12]。因此,在实验中仅设纤维素酶在50℃
84安徽农业大学学报2005年由图5可见,经酶处理过的菌液中不溶固形物明显减少,浓度0.1%的纤维素酶处理3h变化非常明显,菌液中不溶固形物减少了28.0%,而且此时胞内产物腺嘌呤的含量变化也很明显,上升达84.5%,3h以后变化趋势逐渐变缓。酶解处理后样品的HPLC与微波相比,溶液中溶解的物质较其它处理方法为多,这显然是纤维素酶降解纤维素,破坏细胞壁的组成,从而达到破壁的目的。但是就其胞内产物溶出率与微波法相比较两者没有显著的差异,在处理过程中微波法只需处理4min腺嘌呤含量就可以达到25μg mL,而酶解法需要3h才能达到相同的效果,甚至还略低于微波处理方法。将样品过HPLC分析柱,出现6个峰,将其保留时间与核苷标样的保留时间相对照,推断酶解法处理后的溶液中可能含有黄嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤、腺嘌呤、腺苷和虫草素。与微波法相对照,酶解法的条件过于温和,处理后的样品中少了尿苷、黄嘌呤,而多了次黄嘌呤,这可能是因为纤维素酶更容易破坏次黄嘌呤与细胞核的结合,而对尿苷和黄嘌呤与细胞的致密结合难以打破。虽然酶解法处理的样品中也含有好几种物质,但是各个峰之间没有完全分离开来,总的峰面积与微波法相差无几。总体而言,微波法操作简便,成本低廉,要优于酶解方法。
2.2.3 自溶法破壁效果 自溶法是一种特殊的溶酶方式,其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。事实上,在微生物生长代谢过程中,大多都能产生一定的水解自身细胞壁上聚合物结构的酶,以便使生长繁殖过程进行下去。控制一定条件,可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力,以达到细胞自溶的目的[14]-1。本试验是通过在菌液加入NaCl,使其达到一定的浓度进行处理的。从图7中可以看出,不溶固形物的含量随处理时间延长而减少,这是因为NaCl溶液中,存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,引起细胞膜发生破裂,使得细胞水解酶与底物接触而被激活,分解细胞,原生质外溢,胞内产物释放致使不溶固形物减少。但是在处理12h后不溶固形物的量减少很快,之后下降趋势逐渐变得缓慢。而胞内产物腺嘌呤的含量随时间递增,且在增加到一定程度后,增幅逐渐减小,甚至在处理24h时腺嘌呤含量略微下降,这是因为自溶法不仅只是细胞壁被部分水解,而且处理时间过长细胞本身所具有的各种酶类在自溶时会分解腺嘌呤等核苷类物质。就出峰个数以及总峰面积而言(图8),不仅峰的个数比微波法和酶解法要少,仅为4个,其保留时间分别为2.7500、3.8833、5.2833和6.8833,与核苷标样的保留时间相对照分别为尿苷、黄嘌呤核苷、腺嘌呤和腺苷,而且其总峰面积也不到微波处理法的1/10,仅为4678.728。因此,与上述两种方法相比较,自溶法不仅处理时间过长,而且其内含物溶出率也明显低于微波法和酶解法
。
2.2.4 酸热法破壁效果 酸热法破碎细胞,主要是利用盐酸对细胞壁中的某些成分(主要是多糖和蛋白
质)的水解作用,改变这些物质的空间结构,使原来的结构紧密的细胞壁变得疏松,同时经沸水浴处理,造成细胞膨胀并加速水解,破坏胞壁结构,使得细胞内含物外泄释放
产物释放的结果,此与杨文等[16][15]。从图9中可以看出,不溶固形物的含量随处理时间增长而减少,这是因为菌丝体细胞壁破碎后,胞内在研究红酵母胞壁破碎方法中得出的结论一致。但是在进一步的薄层分析时,结果发现已经检测不到胞内产物腺嘌呤,这可能是由于盐酸的作用而使细胞内代谢产物核苷类物质受到破坏。处理后不溶固形物颜色明显变化,带有一股刺鼻的酸味,这可能是由于酸热法处理的条件太过强烈,破坏了菌液中某些物质或者与胞内物质发生化学反应,而且在后续处理HCl难以除去。其HPLC图,、(,
32卷1期钟 石等 4种破碎方法对古尼虫草内含物提取的初步研究85这与TLC检测的结果相一致。因此,无论从胞内产物的溶出率还是HPLC的出峰个数而言,与微波法、酶解法和自溶法相比较,酸热法的破壁效果是最差的
。
除了上述几种破壁方法的比较之外,还做了冻融法(-70℃,冻融4次)与超声波(20Hz,1min)方法 处理后样品的HPLC,但是结果差异不是太大。
3 讨论
就微生物而言,等量的同种菌丝体中不溶固形物和可溶性固形物的总和一般为一定值。但在分析时比较容易测定,不溶固形物只需抽滤烘干称重即可;可溶性固形物可以采用手持糖量计来检测,但测量误差比较大,而采用冻干的方法又比较繁琐。因此,在本试验中选用简便易行的不溶性固形物作为衡量标准。
微波技术应用于生物胞内耐热物质的分离提取,具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著的特点,在分析方面体现了操作简便、快捷、高效的优点,在实际生产过程中具有安全、节能的潜力[11]。目前,微波设备技术成熟,在食品和医药行业的应用也越来越广泛。
纤维素广泛存在于真菌的细胞壁中,构成细胞壁的骨架结构。在本试验中,纤维素酶对虫草菌丝体破壁效果较为明显,这说明纤维素在虫草细胞壁中含量较大,在其细胞壁结构中起重要作用,故而用纤维素酶来进行细胞破壁效果较好。
自溶作用是酶解的另一种方法,在一定程度上能用于工业生产,但对不稳定的微生物则容易引起蛋白质变性,自溶后细胞培养液过滤速度也会降低。
酸热法在古尼虫草细胞破碎条件的筛选中破坏菌液中某些物质,这有背于进行破壁处理的目的,不利于进一步提取胞内产物,因此在古尼虫草代谢产物的生产实践中是不可取的。
通过对超声波法、微波法、自溶法、酸热法以及酶解法等对交织顶孢霉菌丝体破壁作用的效果进行了比较,发现浓度为0.1%的纤维素酶在50℃条件下处理3h破壁效果最好,但酶的价格较高,回收过程繁琐,无论从经济因素还是从推广利用的可能性方面考虑,不适于现代工业化生产,故微波低温解冻档处理4min为细胞破碎较为理想的方法。考虑到微波处理造成的局部升温过快,每处理1min要对菌液进行流水冷却处理。
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菌 物 学 报 24（3）：344~348, 2005
Mycosystema
古尼虫草无性型的分子鉴别
张泽文 傅 岚 陈作红*
（湖南师范大学生命科学学院 长沙 410081）
摘 要：采用PCR技术，以rDNA的ITS区为分子指标，对古尼虫草Cordyceps gunnii的有性
和无性阶段进行比较分析，从分子水平上证明古尼虫草的无性阶段是古尼拟青霉Paecilomyces
gunnii。
关键词：古尼拟青霉，rDNA ITS区
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2005）03-0344-0348
古尼虫草Cordyceps gunnii（Berk.）Berk.是一种寄生于蝙蝠蛾幼虫的较大型虫草，它
是一种复合型真菌，具有有性型和无性型两种生活形态，梁宗琦（1983）首次报道为我国
新记录种；梁宗琦（1985）采用多批次组织和孢子分离，以分离物的培养性状和形态特征
为鉴定依据获得了古尼虫草的无性型——古尼拟青霉Paecilomyces gunnii Z.Q. Liang新种;
刘爱英等（1997）利用子囊孢子微循环产孢再次确认古尼拟青霉为古尼虫草无性型。
随着分子生物学的飞速发展，DNA序列测定已被应用到虫草无性型的鉴定上，为无性
型的鉴定提供了准确的依据。为了证明古尼虫草无性型的准确性，本文以rDNA 18S和25S
之间的转录间隔区（ITS区）为分子指标，通过对古尼虫草子实体和分离纯化的古尼虫草
无性型—古尼拟青霉两种材料的ITS区序列进行比较分析，从分子水平对古尼虫草的无性
阶段进行分子鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
古尼虫草Cordyceps gunnii （Berk.）古尼拟青霉Paecilomyces gunnii Berk.采自湖南浏阳；
Z.Q. Liang从古尼虫草子座中分离纯化得到，并从形态上按梁宗琦（1985）报道的方法得
以确认。
1.2 试剂
1.2.1 DNA提取试剂：SDS，氯仿-苯酚-异戊醇，无水乙醇，超纯水，Lysbuffer裂解液 (灭
菌后配制)：Tris-HCl（pH7.6）1 mol/L 5%； NaCl 5 mol/L 2%; EDTA （pH8.0） 0.5 mol/L
20%]，蛋白酶K 20g/L，10% SDS (十二烷基硫酸钠) 10%
1.2.2 琼脂糖凝胶电泳试剂：琼脂糖，（pH7.6，1×TAE缓冲液 2.5 mL Tris-HCl加5 mLEDTA
调pH定容至250 mL），EB（溴化乙锭0.5 mg/L），溴酚蓝（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶
液） 基金项目：湖南省教育厅青年基金资助项目（01B010）
* 通讯作者E-Mail:chenzuohong@263.net
收原稿日期：2005-02-28，收修改稿日期：2005-05-10
3期 张泽文等：古尼虫草无性型的分子鉴别 345
1.2.3 PCR扩增试剂：PCR试剂盒（购自上海生工）（10×buffer，dNTP，MgCl2，Taq酶），
超纯水，DNA模板
1.3 古尼虫草子座及菌丝DNA的SDS法提取与检测
采用SDS法提取总DNA（Sambrook & Russell，2001），得到古尼虫草子座和菌丝体的
DNA溶液，4℃保存备用。
取10µL提取的DNA溶液与2.0 µL 溴酚蓝混匀点入琼脂糖凝胶，用1×TAE缓冲液
在3 V/cm下电泳，约45 min后在紫外分析仪上检测条带。
1.4 ITS区片段的扩增
ITS序列采用双引物ITS4 + ITS5扩增，此为真菌常用的引物。 ITS4为26S rRNA基
因5`端下游31-50个碱基处，取其互补序列为5`-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC –3`，ITS
5序列为5`-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3`，引物交由上海捷倍思公司合成。
1.4.1 扩增的反应体系 (25µL)：超纯水15.75µL l，10×Buffer 2.5µL，2mmol/L dNTP 2.5µL,
25mmol/L MgCl2 1.5µL，10 pµL/µL, ITS4 1µL，10pµL/µL ITS5 1µL，Taq酶0.25µL，模板
0.5µL。
1.4.2 扩增程序：95℃ 5 min，暂停加入Taq酶；95℃ 1 min，56℃ 30 s, 72℃ 50 s，重复
1次；95℃ 30s, 56℃ 30 s, 72℃ 50 s, 循环37次；72℃10 min, 20℃保温。
1.4.3 电泳检测：同上。
1.4.4 测序：扩增产物的纯化与测序均由上海博亚生物技术有限公司在DNA自动测序仪上
进行测序。
2 结果与分析
2.1 DNA纯度的检测
如图1示，从古尼虫草子座与菌丝体中提取的DNA溶液，经琼脂糖凝胶电泳检测, 从
电泳图谱可看到，其基因组DNA大小一致，约21000 bp，且为一条明显亮带，证明其纯
度较高，可进一步进行PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物的电泳检测
运用PCR技术从古尼虫草子座与古尼拟青霉的DNA中特异扩增了rDNA的ITS序列，
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后（如图2）大约在700 bp处可以看到清晰的条带。该产【古尼虫草】
物交由上海博亚生物公司纯化并直接在自动测序仪上进行测序。
2.3 ITS序列的分析
根据博亚公司的测序结果，得到古尼虫草子座（CG）和古尼拟青霉（PG）全部ITS
区（ITS1+5.8S区+ITS2）的序列（表1），两者的序列完全一致，整个ITS区共计585 bp，
其中ITS1为212 bp，5.8S为156 bp，ITS2为222 bp，显然是属于同一生物种的不同生长
阶段，前者为其有性型，后者则为其无性型。从而从分子水平上证明分离得到的菌丝体确
为古尼虫草的无性型，即古尼拟青霉。
与冬虫夏草Cordyceps sinensis的ITS区（ITS1+ 5.8S区+ITS2）相比（表1），古尼虫
草 5.8S rDNA 的长度与冬虫夏草的完全一样，均为156 bp，其中变异碱基位点仅有4个，
整个性状位点的2.5%，表明核糖体基因高度保守；两者的ITS1（表1中第1~212个碱基）
和ITS2（表1中第369~590个碱基）的长度变化较大，变异位点较多，ITS1区共212 bp，【古尼虫草】
变异碱基有98 bp，占整个性状位点的46.2%；而ITS2区共222 bp，变异碱基有79 bp，占
346 菌 物 学 报 24卷 整个性状位点的35.6 %。整个ITS区域的一致性达到69.3 %。
图 1 总DNA电泳图谱
1. 标准DNA; 2. 子座; 3. 古尼拟青霉
Fig. 1 DNA profile on agarose gel
1：Marker 2：Stroma 3：P. gunnii 图 2 ITS序列PCR扩增电泳图谱 1. 标准DNA; 2. 子座; 3. 古尼拟青霉 Fig. 2 ITS region profile on agarose gel generated by PCR amplification
1：Marker 2：Stroma 3：P. gunnii
表1 冬虫夏草和古尼虫草的ITS1、5.8 S和ITS2序列
Table 1 Aligned sequence of ITS1, 5.8S and ITS2 from Cordyceps sinensis and C.gunnii
CS ATTATCGAGT ---TACCACT CCCAAACCCC CTGCGAAC-- 40
PG ****C***** TCT***A**C T**C**A*** ***T****TT
CG ****C***** TCT***A**C T**C**A*** ***T****TT
CS --ACCACAGC AGTTGCCTCG GCGGGACC-- GCCCCGGCG- 80
PG AT***TATA* T*****T*** *****T*TTT *******G*A
CG AT***TATA* T*****T*** *****T*TTT *******G*A
CS ---------- ---------- ---CCCCAGG G-----CCCG 120
PG CGGACAGGGA GCCGGCAACG GCC****T** AAACCC****
CG CGGACAGGGA GCCGGCAACG GCC****T** AAACCC****
CS GACCAGGGCG CCCGCCGGAG GACCCCCAGA -------CCC 160
PG **A*CA**** *T******G* A**T*AA*CT CTGTATTT*T
CG **A*CA**** *T******G* A**T*AA*CT CTGTATTT*T
CS TCCTGTCGCA GTG-GCATC- TCTCAGTCAA GAAGCAAGCA 200
PG CTT*ACT*T* T**TAT*C*G **G***G*C* A**AA*CAA*
CG CTT*ACT*T* T**TAT*C*G **G***G*C* A**AA*CAA*
CS AATGAATCAA AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG 240
PG ********** ********** ********** **********
CG ********** ********** ********** **********
CS CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA AGTAATGTGA 280
PG ********** ********** ********** **********
CS ********** ********** ********** **********
3期
续表1 张泽文等：古尼虫草无性型的分子鉴别 347
CS ATTGCAGAAT TCAGTGAACC ATCGAATCTT TGAACGCACA 320
PG ********** ********T* ********** **********
CG ********** ********T* ********** **********
CS TTGCGCCCGC CAGCACTCTG GCGGGCATGC CTGTCCGAGC 360
PG ********** ***T****** ********** ****T*****
CG ********** ***T****** ********** ****T*****
CS GTCATCTCAA CCCTCGAGCC CCCCGCCTCG CGGC------ 400
PG *****T**** *****AG**A ****C*GCT* ****TGTGGC
CG *****T**** *****AG**A ****C*GCT* ****TGTGGC
CS GGCGGG--GC CCGGCCTTGG GGGTCA---- ------CGGCC 440
PG **G***GA** *T**TG**** **AC*GGCGG AAAACCT****
CG **G***GA** *T**TG**** **AC*GGCGG AAAACCT****
CS CCCG------ -CGCCGCCCC CTAAACGCAG TGGCGACCCC 480
PG ***AGGGCAG C********* *****T*A*T *****G**T*
CG ***AGGGCAG C********* *****T*A*T *****G**T*
CS GCCGCGG--C TCCCCTGCGC AGTAGCTCAC CGAGAACCTC 520
PG *T*****CC* ***T*****T ******A*** -----*****
CG *T*****CC* ***T*****T ******A*** -----*****
CS GCACCGGAAG CGCGGAGGCG GTCAC-GCCG TGAAAC-CAC 560
PG ***A***G** *C***C**** *C***T**** *A****G***
CG ***A***G** *C***C**** *C***T**** *A****G***
CS CACGCCTTCC -----AGTTG ACCTCGGATC 590
PG A*TCTTC**T TCTAG***** ******A***
CG A*TCTTC**T TCTAG***** ******A***
-- ：表缺失数据； *：表相同碱基位点； 下划线为5.8 S 区
-- ：Gaps required for alignment； *：The same base site； Underline are 5.8S region
CS: 冬虫夏草子座(Stroms of C. sinensis)； CG: 古尼虫草子座(Stroms of C. gunnii)； PG: 古尼拟青霉(P. gunnii) 3 讨论
关于虫草无性型的分离与确证，在形态特征方面，梁宗琦等做了大量工作，并取得了可喜成绩（梁宗琦，2001），方法有三：1，多途径多批次分离确定；2，虫草子囊孢子微循环产孢直接确证；3，在特定人工培养基上诱发虫草有性子实体的确定。近年来随着分子生
C. soboliferaC. brittlebankisoides、物学的发展，利用分子生物学手段在确定冬虫夏草、蛹虫草、
等多个种类的无性型也取得了很好的进展。李增智等（2000）从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢，并利用RAPD-PCR技术获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组DNA指纹图谱，两者相似率高达96%，从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢；赵锦等（1999）以rDNA18S和25S之间的ITS区为分子指标，通过对冬虫夏草及相关种类有性和无性阶段材料的ITS序列分析进行比较分析，从基因水平证明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢； Liu et al.(2001,2002)应用ITS序列分析的方法，研究表明冬虫夏草标本与相应
348 菌 物 学 报 24卷 的无性型分离物中国被毛孢之间的ITS序列完全一致，蛹虫草和其无性型分离物蛹虫拟青霉ITS序列差别很小。利用分子生物学手段是从遗传物质上探讨虫草无性型与有性型的关系且不受其生活史不同阶段的影响，因此已成为确定虫草无性型重要方法。
本文对古尼虫草的菌种进行了分离，培养纯化后制片镜检，可从形态学上确认是古尼虫草的无性型即古尼拟青霉。赵锦等（1999）曾对古尼拟青霉的rDNA进行了序列测定，但仅只测出ITS1区和5.8 S的部分序列。本文利用分子生物学手段，对古尼虫草的子座和分离培养的古尼拟青霉菌种的rDNA的完整ITS区进行序列测定，并进行比较，结果证明分离到的菌种确为古尼虫草的无性型即古尼拟青霉。
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MOLECULAR IDENTIFICATION OF THE ANAMORPH STAGE OF
CORDYCEPS GUNNII
ZHANG Ze-Wen FU Lan CHEN Zuo-Hong
(College of Life Science, Hunan Normal University, Hunan, Changsha 410081 )
ABSTRACT: The rDNA ITS (internal transcribed sparce) from the teleomorph stage and the anamorph stage of Cordyceps gunnii were amplified with PCR technology , then the PCR products were sequenced and compared. The results indicated that the ITS sequences of them were concordant completely, which suggested that the anamorph stage of C. gunnii should be Paecilomyces gunnii.
KEY WORDS:, Paecilomyces gunnii, rDNA ITS