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僵蚕，是一种比较特殊的产品，它又名白僵蚕，是家蚕幼虫在吐丝前因感染白僵茵而发病致死的干涸硬化虫体，由于其体表密布白色菌丝和分生孢子，形似一层白膜，故名，主要用于惊风抽搐，咽喉肿痛，颌下淋巴结炎，面神经麻痹，皮肤瘙痒等病症。
僵蚕是一味常用中药，味辛、咸，性平，具有祛风解痉，化痰散结，清热解毒燥湿的功效，临床多用于治热咳，痰喘，吐血，崩，带，跌打损伤，风湿痛，疮毒等，近年来其应用范围和领域不断扩大。
目前，药用僵蚕在中药材市场上需求趋旺，僵蚕在毫州药材市场的统货价格为56-60元／公斤（2010/09/16日价格），养殖和加工僵蚕有着很好的前景。
养殖前景和效益：
一张蚕种（约18000-25000粒蚕）可收获僵蚕达30 kg，僵蚕市场价格一般25元／kg以上，高者甚至达到了60元／kg，如此张种可获利700～1800元，加上饲养环节减少的投入，如簇具、蚕药、桑叶的节省等，药蚕育的收益比正常年景春季丝茧育高出34％左右，如果价格高则还不止。
【中药名称】僵蚕
【来源】本品为蚕娥科昆虫家蚕BombyxmoriL.4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.而致死的干燥体。
多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的蚕干燥。
【性状】本品略呈圆柱形，多弯曲皱缩。
长2～5cm，直径0.5～0.7cm。
表面灰黄色，被有白色粉霜状的气生菌丝和分生孢子。
头部较圆，足8对，体节明显，尾部略呈二分歧状。
质硬而脆，易折断，断面平坦，外层白色，中间有亮棕色或亮黑色的丝腺环4个。
气微腥。
味微咸。
【鉴别】本品粉末灰棕色或灰褐色。
菌丝体近无色，细长卷曲缠结在体壁中。
气管壁碎片略弯曲或弧状，具棕色或深棕色的螺旋丝。
表皮组织表面具网格样皱缩纹理以及纹理突起形成的小尖突，有圆形毛窝，边缘黄色；刚毛黄色或黄棕色，表面光滑，壁稍厚。
未消化的桑叶组织中大多含草酸钙簇晶或方晶。
僵蚕养殖技术：
了解详细：/Article/Article_18631.html
一、成蚕饲养。饲养和加工药用僵蚕，全年都可以进行。所喂的饲料，除少量桑叶外，可多种些月见草、剑蚕草、白三叶、串叶松香草等替代桑叶，以补充桑叶的不足，降低饲养成本。对成蚕的饲养管理技术，与常规养蚕相同，需一直养至四眠。
二、制作菌种。取50个500毫升的空输液瓶，装入凉开水将白僵菌试管母种一支，接入10个瓶中，静置1小时后作原种，再将每瓶原种分别接入5个瓶中，即制成液体菌种。如无试管母种，可用凉开水淘洗自然染病形成的僵蚕，将淘洗后的凉开水，也可作为液体菌种使用。
三、喷洒接种。在成天四眠脱皮苏醒后，用喷雾器将液体菌种均匀地喷洒到蚕的身上，以皮肤见湿为度。若菌株活力差，则应在制成液体菌种后1小时内必须接种。
四、加强管理。在接种菌种15分钟～20分钟后，开始喂草，每5小时～6小时喂1次。一般在接种菌种20小时～24小时，蚕开始厌食，行动呆板，体表渐呈青褐色，有不同形状的黑斑点；到第3天～4天，开始死亡；5天～6天，死亡量达70％，7天～8天，全部死完，在蚕死过程中，要及时挑出死蚕摊放在饲养室内，保持同样的温、湿度，让其充分僵化，以提高成品率及药素含量。
僵蚕加工技术：
僵蚕的加工十分容易，并不需要特殊的设备。但晒干的僵蚕应及时加工处理，防止霉变和虫蛀，降低药用价值。传统的僵蚕加工分净制和炮炙两种，净制就是将僵蚕去杂洗净，用石灰粉拌均吸干水分，充分晒干。炮炙就是将僵蚕倒入热锅内用文火翻炒，至表现呈黄色即可，为防止受热不均出现焦糊，可用麸皮拌炒，僵蚕与麸皮比例为101：，炒好后筛去麸皮即可。
一般合格品呈圆柱形，多弯曲皱缩，长2～5厘米，体径0.4～0.7厘米，体表微黄色，质硬而脆，易折断，断面平，色或棕或黑，多光亮，有4个褐色亮圈；微有腐臭味，微咸。
注意事项：
僵病是蚕茧生产，特别是秋蚕饲养中的多发病种，其真菌孢子的主要传染介质主要是空气和桑叶，因此养蚕比较集中的地区尽量不要出现丝茧、药蚕混育现象，僵蚕晾晒要远离蚕室，尽量在野外进行，从药蚕育转变成丝茧育，要对蚕室及周边环境进行严格消毒，配制防僵粉要适当加大漂白粉的比例，可加大到1．5％，以提高防僵效果。
僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕4—5龄的幼虫感染白僵菌而致死的干燥体。别名白僵虫、僵虫。白僵病是一种古老的传染性蚕病，凡是有蚕茧生产的地区都有白僵病和僵蚕，随着养蚕技术的提高，消毒防病的加强，僵蚕几乎绝迹，医药部门为了满足人民用药需要，曾先后在海南、江苏投资，开始人工培养药用僵蚕。
僵蚕味咸、辛，性平。具有祛风定惊、化痰散结的功效，主治惊风抽搐、咽喉肿痛、颌下淋巴结炎、面神经麻痹、皮肤瘙痒等症。
一、僵蚕生物学特性
(一)形态
成虫又叫蚕蛾，体长16—23毫米，展翅宽39—43毫米。头小，复眼黑色，半圆形。触角羽毛状。口器退化。翅2对，前翅较大，略成三角形，后翅较小，略成圆形，翅面有白色鳞片。雌性腹部肥硕，末端钝圆。雄性腹部狭窄，末端稍尖。雄体分8节，雌体分7节，各节侧面有新月形的气门1对。末端有交尾器。跗节5节。有1对黑褐色的爪。幼虫叫桑蚕，圆筒形灰白色，由13节组成，前3节是胸部，后10节是腹部。头部有触角1对。嘴有一对几丁质的大颚，大颚下方中央，有白色的吐丝管。口器咀嚼式。在桑蚕的胃部下方两侧有管状物，叫“丝腺”
(二)生活习性
蚕蛾成虫白茧内羽化，不取食即交配产卵，以卵越冬。卵孵化后，成幼虫，叫“桑蚕”，以桑叶做食料。桑蚕经过4天休眠后，丝腺发育显著，能制造丝浆。丝浆经过吐丝口分泌出来，遇空气就凝结成丝，由下唇须缫丝成茧。蚕结茧后，化成蛹，浓褐色，外有几丁质的外骨骼，受刺激时，能左右摆动。蛹经过5—6天，如果不收茧杀蛹，就会羽化成蚕蛾。蚕蛾咬破茧，爬出茧外就是成虫。
僵蚕的形成是家蚕的幼虫(即桑蚕)被一种叫白僵菌的分生孢子附着在蚕的皮肤上，这种孢子，遇到适当的温度和湿度，经过6—8小时就发芽，生出芽管，侵入到蚕体中去，形成孢子，摄取营养，蚕就逐渐衰弱死亡。蚕死后，由于菌丝的蔓延和大量繁殖，吸收养分和水分，使蚕体干燥，同时，菌丝分泌的草酸钙，堆积在尸体内，促使尸体硬化，于是就变成粉白色的僵直死蚕，这就是僵蚕。
二、僵蚕养殖技术
(一)白僵菌培养
白僵菌属半知菌纲线菌目淡色菌科白僵菌属。菌种的来源，由僵蚕尸体上的白僵菌孢子，经分离选取优质单株菌落移植于斜面培养基上，在25—28℃的恒温下进行培养。经10天左右，将提纯分离所得的纯种在5℃低温下保存用于扩大培养。白僵菌的培养过程，用下列公式简示僵蚕养殖技术：
带活孢子的僵蚕尸体(分离提纯)
斜面培养基接种一级菌种(固体发酵培养)
二级菌种(蚕体复壮)
三级菌种(供生产接种用)
(二)1—4龄桑蚕养殖技术及防病
1—4龄蚕的饲养要特别加强蚕体、蚕座的消毒，防止小蚕发僵蚕病死亡。对僵蚕病的防治，除蚕室、蚕具消毒外，应重点抓住两个方面，即杀灭病源；切断感染途径和控制温度等发病条件。
(1)消灭感染源
病蚕、蚕沙要及时处理，旧簇具必须烧毁，蚕沙要挖坑沤制堆肥，商品僵蚕要及时烘干灭菌，菌种僵蚕要密闭保管，蚕室、蚕具要清冼消毒，防止病源体飞散传染。
(2)使用防僵药剂
防僵药剂的使用，是有效防止白僵菌侵入蚕体寄生的办法。一般每个龄期使用二次防僵药剂，如发现小僵蚕，每天使用一次防僵药，但眠中停用。
(三)5龄响食后接菌
(1)准备
在蚕发育至5龄响食后首先要做好蚕补湿准备工作，调节湿度以求接菌后迅速达到一定湿度状态，以使白僵菌良好发育，迅速进入蚕体。
(2)菌液调制
接菌之前测定菌种僵蚕的孢子数，做发芽试验测定菌种的毒力，按照孢子数的多少和菌种毒力的大小，确定合理的菌种加水量。按照所需水量先取三分之二，把菌种僵蚕浸入水中充分擦洗，洗到僵蚕体上白色粉末全部洗落为止，用滤纱滤去蚕组织及粗碎片
(3)菌液浓度
菌液浓度根据菌种的毒力，不同品种的蚕五龄期的长短，接菌当时的温湿度条件灵活掌握。一般掌握在白僵菌孢子数每立方毫米3.6—6万个，干旱季节要浓，多湿季节要淡。
(4)接菌量
每0.11平方米蚕座面积喷菌液40—45毫升。干燥季节可以适当增加菌液量。
(5)接菌时期
五龄起蚕开叶之后3—5小时。
(6)接菌方法
用专用的农用喷雾器将菌液均匀喷于五龄开叶后的蚕体上，接菌后经10—20分钟给桑叶，16—20小时除沙，以保证有多湿环境，利于白僵菌孢子侵入蚕体，提高成僵率。
(7)温湿度
接菌后，温度保持24—30C，相对湿度保持在90％以上，经过一昼夜，恢复丝茧蚕培育的一般要求。
(8)发病
接菌后经3—3.5天开始出现病斑，首先出现在气门周围，使气门颜色变深，轮廓变大，渐至围绕气门扩大成黑褐色块状斑，周围油迹透明，还有病斑出现在尾部肛门附近或尾角变焦黑等，虫体一般在接菌后5—6天死亡，在适温范围内温度高发病早死亡快，温度低死亡慢。
(9)僵蚕养殖技术注意事项
①接菌后至第1次除沙前的16—20小时内必须做好温度、湿度调节工作，春季温度不低于24℃，夏秋季温度不高于30C，相对湿度控制在90％以上。
②初死僵蚕的尸体尚未发红变硬以前，防止30"C以上高温，以减少细菌性烂蚕发生。
③接菌后仍需按照丝蚕培育的规定使用防蝇和防其他蚕病(臼僵病除外)的药剂。
２００６年ｌｏ月第２６卷第５期
ｏｃｔ．２００６ｖ０１．２６Ｎｏ．５
Ｊｏ啪ａｌ
湖南中医药大学学报
ｏｆＴＣＭＵＩｌｉｖ．ｏｆＨｕｎａｎ
１１
・方药研究・
僵蚕抗凝活陛成分的稳定性和提取工艺研究
彭新君１，许光明１，彭延古２，曾序求２
（１．湖南中医药大学药学院，湖南长沙４１０００７；２．湖南中医药大学血管生物学实验室，湖南长沙４１０００７）
［摘要】目的研究僵蚕提取液的抗凝活性成分的稳定性和提取工艺。方法以凝血酶时间（’ｒｒ）为指标，考察
僵蚕提取液中抗凝物质对酸、碱、热及反复融冻的稳定性；以紫外分光光度法测其蛋白含量为指标，用郇４）正交
试验考察僵蚕的提取工艺。结果僵蚕水提液的抗凝活性成分对酸、碱、热及反复融冻均具有较高的稳定性：僵蚕
水提浪讷凝血酶时间与蛋白质含量成正相关湫０．０１）：以蛋白质含量作为指标，僵蚕用８倍量水润湿１５
供了实验依据。
（关键词】僵蚕；抗凝活性成分；稳定性；提取工艺［中图分类号）Ｒ２８４．１，Ｒ２８４．２
［文献标识码】Ａ
［文章编号】１０００—５６３３（２００６）０５—００１１一０３
ｍｉｎ，提
取２次。每次３０ＩＩｌｉｎ。即为水煎提取优化工艺。结论为僵蚕抗凝活性成分的水煎提取和后续分离的样品处理提
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僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕（Ｂｏｍｂ）ｒ】【ｍ耐Ｌ）４—５龄的
幼虫感染（或人工接种）白僵菌【Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂ鹕ｓｉ８ｒ璩（Ｂａｌｓ）Ｖｕｉｌｌ】而致死的干燥体，为传统中药。早在《神农本草经》中已有记载，僵蚕具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功
［收稿日期】２００６＿Ｄ５—２４
【基金项目）国家自然科学基金资助项目（３０１７１１５９）。
效。目前多用于治疗癫痫、顽固性头痛等疾病，实验证明僵蚕提取液具有明显的抗凝、抗血栓及促纤溶作用【１一。为进一步研究僵蚕的抗凝活性，本实验探讨了受热时间、冻融次数、溶液ｐＨ值对僵蚕提取液抗凝活性的影响以及
［作者简介】彭新君（１９４８一），男，湖南双峰人，教授，从事分析化学和药物分析。
１２湖南中医药大学学报２００６年第２６卷
提取工艺。现报道如下。
水稀释８倍，然后取２．０ｍＬ分装于６个１０ｍＬ试管中。密塞，精密称定，置于沸水浴中加热，各管加热时间３￣４０１实验材料
ｍｉｎ不等，停止加热后，冷却，精密称定，水分损失的相对误１．１仪器
差超过２％以上者，用移液枪加水补足到原重，离心，按２１Ｓｔａｒｔ－４半自动四通道血凝仪（法国ＳＴＡＧＯ公司），项下测定各管溶液的凝血酶时间，分别平行测定３次，与加４３００＿Ｐｒ０紫外分光光度计（瑞士安玛西亚公司），ＨＲ２８３８型热时间Ｏｍｉｎ的样品进行比较。结果表明４℃下保存的僵匀浆机（菲利普公司），电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械蚕水提液在沸水加热过程中。随加热时间的延长其活性不厂），ｏ．１ｍＬ和１．ｏｍＬ移液枪（芬兰）。断增高，但３０ｍｉｎ后ＴＴ值达到稳定，加热到２ｈ也未见活１．２试药
性下降。可见僵蚕水提液对热稳定性较高，见表２。
僵蚕（购自湖南振兴中药饮片有限公司），凝血酶，兔表２僵蚕水提液热稳定性
（；虹．ｎ＝３）
血浆，生理盐水；无水乙醇，盐酸，氢氧化钠均为分析纯。
加热时间（ｍ询
０
５
１０
２０
３０
３５
６０
１１鞫５＆９±弘６３．缸５３７ｎ６矾ｌ７７６岱Ｏ１仿．１±５２
１１ｌ触帖１憾斛７
２方法与结果
２．３．３反复冻融的稳定性将２．２项下制备的僵蚕粗提２．１凝血酶时间（，Ｉ’Ｉ＇）的测定
液取用蒸馏水稀释８倍．然后取２．ＯｍＬ分装于５个试管先取凝血酶用生理盐水稀释至一定的倍数，然后取中，将各管样品进行反复冻融，冻融次数４—１３次不等，最待测血浆（参比血浆）０．１ｍＬ，３７℃孵育２ｍｉｎ，加入生理后，各样品于室温下一起解冻，摇匀，３
０００
ｒ／ｍｉｎ离心１０
盐水Ｏ．１ｍＬ和３７℃预温的凝血酶０．１ｍＬ，摇匀，用ｍｉｎ，按２．１项下测定各管上清液的凝血酶时间，每个样品Ｓｔａｎ－４半自动四通道血凝仪测其凝血酶时间．调节凝血测３次。结果表明僵蚕水提液的活性基本上与冻融次数无酶稀释倍数，使空白，Ｉ－Ｉ’值在１６～１８ｓ。然后用僵蚕提取关（Ｐ＞Ｏ．０５），见表３。说明僵蚕水提液对反复冻融有较好
液代替该法中的生理盐水．同样操作测定各样品的ＴＩ＇值的稳定性。
即得。
表３僵蚕水提液对反复冻融的稳定性
（船ｓ。，ｌ＝４）
２．２僵蚕水提液的制备
序
号
ｌ
２３４５取僵蚕１００ｇ，筛去尘渣后用８倍量水浸泡１５
ｍｉｎ，冻融次数０
４
７
ｌＯ
１３
以３０００ｒ／ｍｉｎ匀浆，然后煎煮２次，每次３０ｍｉｎ，过滤合
卫！１２塑：！丝：兰箜：！圭：： ．垒！：；生：ｉ垒！：ｉ望：！箜：兰丝：１
并滤液，离心去渣后浓缩至１００ｍＬ＇加无水乙醇至６０％２．４蛋白质含量测定方法网
的浓度，４℃放置过夜。３０００
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃渣，
将僵蚕水提液分别稀释不同倍数。用生理盐水作空然后取上清液水浴浓缩至含生药２ｇ／ｍＬ溶液，于４℃
白对照，测定其凝血酶时间（盐水空白的Ｔｒ为１７．２ｓ）；低温冰箱中保存备用。
再各取稀释不同倍数的僵蚕水提液分别适当稀释。测定
２．３僵蚕水提液的稳定性测定
２８０
ｎｍ和２６０ｎｍ波长处的吸光度（即Ａ抛。和如鳓。），
２．３．１
对酸、碱的稳定性将１
ｍｏＬ／ＬＨＣｌ和１
ｍｏｌ／Ｌ
按下列公式计算蛋白质的浓度。
ＮａｏＨ分别加至两管制备的僵蚕水提液（各５．０ｍＬ）中，使各自ｐＨ１．Ｏ和１３．０，４℃低温静置２蛋白质浓度（ｍｇ／ｍＬ）＝１．５５Ａ麓☆ｍ－Ｏ．７５Ａ轴
ｈ后，再分别用由此再计算出ＴＴ测定的反应杯中僵蚕蛋白的浓度１ｍｏＬ／ＬＮａｏＨ和ｌｍｏｌ／／ＬＨＣｌ将溶液调至中性，并保（ｍｇ／ｍＬ）。用凝血酶时间（ＴＴ，ｓ）对蛋白浓度（Ｃ，ｍｇ／ｍＬ）持样品浓度相同。再分别用上述中和的同浓度盐溶液，制进行线性回归，得回归直线方程为：
备僵蚕样品液，与生理盐水空白及对照样（水稀释至相同７兀＝６．３６Ｃ＋１４．２（ｒ＝Ｏ．９９２，，ｌ＝５）；线性范围：蛋白质浓样品浓度），按２．１项下测定各管溶液的凝血酶时间，分度为６—９６别平行测定３次。结果表明经过酸、碱处理后的药液活性ｍ∥ｍＬ和，ＩｆＩ．为２４—６００ｓ。
经回归直线方程的相关系数检验，凝血酶时间与蛋与同浓度盐溶液相比没有差异（Ｐ＞Ｏ．０５），说明僵蚕水提白质浓度呈良好的线性关系（Ｐ＜Ｏ．０１）。液活性不受ｐＨ的影响。和对照药液相比活性有所增强，２．５僵蚕抗凝活性成分的提取工艺研究
这可能是中和ｐＨ值时所产生的盐对活性成分有协同抗２．５．１提取方法的选择样品溶液的制备：①水冷浸液：
凝的作用所致（Ｐ＜０．０１），见表１。
取１００ｇ僵蚕，加６倍量的蒸馏水，室温（１５—１８℃）浸泡表１僵蚕水提液对酸、碱的稳定性
（茹赶。ｎ＝３）
后，用匀浆机匀浆后，第１次浸泡６ｈ，第２次浸泡４
ｈ，
样品酸处理药液碱处理药液同浓度盐的药液对照药液生理盐水
不时对其进行搅拌，合并２次浸泡液，６０℃减压浓缩成７Ⅲｓ）８９．１±５．６・
７８．５“．８・
８３．７±５．２“５９．３±３．７１８．２±２．３
含生药Ｏ．２５ｇ／ｍＬ混悬液。②醇提液：取１００ｇ僵蚕，加６注：与同浓度盐的药液比＋Ｐ＞０．０５。与对照药液比Ａ△．Ｐ＜ｏ．０ｌ。
倍量６０％的乙醇，用匀浆机匀浆后，进行回流提取，第１２．３．２热稳定性将２．２项下制备的僵蚕水提液用蒸馏
次回流４０ｍｉｎ，第２次回流３０ｍｉｎ，第３次回流２０
ｍｉｎ，
第５期
彭新君，等僵蚕抗凝活性成分的稳定性和提取工艺研究
１３
合并３次回流液，减压浓缩成含生药０．２５∥ｍＬ混悬液。
表６水煎煮提取僵蚕蛋白的实验统计结果
③水提液：按醇提液项下方法，将水代替乙醇，匀浆前样
试验号
里
茎
：堕堂室
堡竺塑塑品用水润湿１５ｍｉｎ，其余同法操作。
垒
璺
曼
里
垒翌
垒堂
堡旦鱼量ｆ竺９２
测定方法：将各组制备的粗提液分装于试管中，用ｌ
１
ｌ
ｌｌ
Ｏ．９９４
Ｏ．８３４
１８．３ｌ
２．１项下的方法测定各组试液的凝血酶时间（Ｔｒ），每个供２３
试样品测１０次，方差分析结果见表４。结果显示，与空白３组比较，除了水浸组以外，水提、醇提组均能明显延长凝２血酶时间（Ｐ＜Ｏ．０１），试验结果初步显示水冷浸取法僵蚕３抗凝成分是不可取的。从表中还可以看出．水提、醇提有ｌ较明显差异（Ｐ＜Ｏ．０１），显示水提组有较好的活性。因此下３一步做僵蚕抗凝成分粗提工艺的研究，采用水煎煮法。１表４各种提取方法凝血蕊时问方差＋比较裹
２
（；虹．胆１０）
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ｉ
４９．５０５７．６０６６．０２５９．２４＝Ｙ＝１７７．４３
Ⅱｉ６１．９２６０．１９５５．５４５５．５９ｃ＝ＧＹ）２／ｎ＝３４９７．９３
Ⅲｉ
６６．０１５９．６４５４．５０５６．５３ＺＹ２＝３５８６．９９
Ｒｉ１６．５１
２．５９
１１．５２３．６５ＳＳ
ｉ
４５．６５１．１６
２４．０８
２．５３
ＳＳｔ＝７３．４２
２．５．２提取次数的选择称取僵蚕１０ｇ。用匀浆机匀浆后，水煮提取２以次，提取液用纱布过滤，３０００ｒ／ｍｉｎ离
心１０ｍ氓取上清液于６０℃减压浓缩至１０ｍＬ。加入６
ｍＬ无水乙醇，进行沉淀（边加边搅拌），立即离心，分取沉淀用蒸馏水洗涤，振摇，离心，反复３次，此上清液定容至
２０
ｍＬ。以紫外分光光度法测定蛋白质含量。得第３次提取
液的蛋白含量仅占３次总提取液蛋白含量的８．Ｏ％。说明第】、２次提取已经比较完全，故以水煎煮２次为宜。
３讨论
２．５．３正交实验优选水煮提取工艺按表５设立实验因
实验结果表明，僵蚕水提液的抗凝活性成分对酸、素与水平，用Ｕ３４）正交表安排试验，称取９份５．Ｏｇ僵蚕粉
碱、热及反复融冻均具有较高的稳定性。这对僵蚕抗凝成（过２０目筛）按２．２和２４项下方法进行试验，结果见表６。
分的提取、浓缩及分离纯化等后续工作都有指导意义。僵表５因素水平表
蚕水提液在低温放置后。需加热３０ｍｉｎ后。凝血酶时间才达到稳定，其原因尚不清楚，有待进一步研究。
僵蚕水提液中蛋白质是其主要成分Ｍ。实验结果表
明，凝血酶时间与紫外分光光度法测定的蛋白质含量成正相关．因此用测定蛋白质含量来代替凝血酶时间的测定，研究方法更简便，但对于不同来源的样品是否可行，
考虑到ＳＳＢ＜ＳＳ空白。这表明Ｂ因素对实验的影响值得进一步研究。
甚微，可认为该列上的离均差平方和主要是实验误差所引起的。为提高分析的精度，可将ＳＳＢ与ＳＳ空白合并为参考文献：
ＳＳｅ（相应的自由度也合并在一起），方差分析结果见表７。
【１】彭延古，葛金文，邓奕辉．僵蚕抗凝血活性初步研究【Ｊ】．湖南中医
以僵蚕蛋白含量为考察指标。由表６中极差Ｒ值大学院学报，２００２，２２（４）：３７＿４０．
小显示各因素作用的主次为Ａ＞Ｃ＞Ｂ。Ａ因素以水平３为【２】彭延古，李路丹．僵蚕抗实验性静脉血栓及作用机理的研究叨．血
栓与止血，２００１，７＜３）：１０４—１０５．
佳，Ｂ因素以水平２为佳，Ｃ因素以水平ｌ为佳，方差分【３】陈琼华．生物化学【Ｍ】．北京：人民卫生出版社，２００２：２５６．
析结果表明，Ａ因素的影响有非常显著意义（Ｐ．（０．０１），Ｃ因素的影响有显著意义（Ｐ＜０．０５），故以懈，组合的提取
ｆ４】卫功庆．白僵蚕化学成分分析叨．吉林农业大学学报，１９９５，１７
（３）：４６—４９．
工艺为佳（表６中８号实验），即称取僵蚕１０ｇ，用８倍量【５】彭新君，赵建国，彭延古．僵蚕提取液中蛋白质和草酸铵等成分的
水润湿１５ｍｉｎ，匀浆后，煎煮提取２次，每次３０ｌＩＩｉｎ，提定量分析叨．中国中医药信息杂志，２００５，１２（９）：３８—４０．
取液按２Ｓ２项下进行过滤、离心、浓缩、醇沉、定容等操作。
僵蚕抗凝活性成分的稳定性和提取工艺研究
作者：作者单位：
彭新君， 许光明， 彭延古， 曾序求， PENG Xin-jun， XU Guang-ming， PENG Yan-gu， ZENG Xu-qiu
彭新君,许光明,PENG Xin-jun,XU Guang-ming(湖南中医药大学药学院,湖南,长沙,410007)， 彭延古,曾序求,PENG Yan-gu,ZENG Xu-qiu(湖南中医药大学血管生物学实验室,湖南,长沙,410007)
湖南中医药大学学报
JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE UNIVERSITY OF HUNAN2006,26(5)2次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
参考文献(5条)
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本文读者也读过(10条)
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5. 彭延古.许光明.赵建国.彭新君.曾序求 僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究[期刊论文]-中国中医药信息杂志2008,15(5)
6. 彭新君.彭延古.曾序求.赵建国.江星明.高俊 僵蚕提取液中蛋白质和草酸铵等成分的定量分析[期刊论文]-中国中医药信息杂志2005,12(9)
7. 殷志琦.叶文才.赵守训 僵蚕中一个新的香豆素苷类化合物[期刊论文]-中草药2004,35(11)
8. 赵建国.彭新君.彭延古.曾序求.江星明.张燕鸿.卢茂芳.ZHAO Jian-guo.PENG Xin-jun.PENG Yan-gu.ZENG Xu-qiu.JIANG Xing-ming.ZHANG Yan-hong.LU Mao-fang 草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响[期刊论文]-时珍国医国药2005,16(6)
9. 李冬生.王金华.胡征.李轶群 白僵蚕主要化学成分及其挥发油的分析[期刊论文]-化学与生物工程2003,20(6)10. 杨永华.张水寒.徐琳本.刘春海.李跃辉 僵蚕、蜈蚣提取工艺的研究[期刊论文]-中国中药杂志2001,26(9)
引证文献(2条)
1.许光明.张前燕.彭延古 僵蚕抗凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用的研究[期刊论文]-中西医结合心脑血管病杂志 2007(9)
本文链接：
九江医学 2008年第23卷第1期 JiujiangMedicalJournal2008,23(1)
·1·
论 著
僵蚕提取物中氨基酸种类与含量测定
赵建国 彭新君 曾序求
1
2
2
(1九江学院医学院 江西九江 332005;2湖南中医药大学 湖南长沙 410007)
摘要 目的:研究僵蚕提取物中组成蛋白质的氨基酸残基种类与含量,为其质量控制和抗凝活性作用物质基础研究提供依据。方法:将样品用盐酸水解后采用RP-HPLC法测定15种氨基酸残基的种类与含量。结果:僵蚕提取物含有15种氨基酸残基,其总量为48.7%,其中谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸残基较多,蛋氨酸和辅氨酸残基在水解过程中被破坏而未测出。结论:僵蚕提取物中的主要成分为蛋白质、多肽类成分,它们含有所测的15种氨基酸残基。该定量方法准确、可控,可用于僵蚕样品中氨基酸残基的分析。 关键词 僵蚕;提取物;氨基酸;HPLC法
中图分类号 R927.2;R977.4 文献标识码 A 文章编号 1006-3838(2008)01-0001-(02)
ASSAYOFAMINOACIDSINBATRYTICATEDSILKWORMEXTRACT
ZHAOJianguo;PENGXinjun;ZENGXuqiu
(1JiujiangUniversityMedicalCollege,JiangxiJiujiang332005;
2TCMUniv.ofHunan,Changsha410004)
oassayaminoacidresiduesinproteinsandpeptidesinbombyxbatryticatusextract.ABSTRACT OBJECTIVE:T
METHOD:ProteinsandpeptideswerehydrolyzedbyHCLintoaminoacidsandthendeterminedbyHPLC.RESULTS:Thecontentsoftotalof15kindsofaminoacidswere48.7%.Croteinsandpeptidescontaining15kindsofaminoONCLUSION:Pacidresiduesarethemaincomponentsofbombysbatryticatusextract.Themethodisaccuratereliableandcontrollable.
1
2
2
KEYWORDS bombysbatryticatus;extract;aminoacids;HPLC 僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriL4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabas-siana(Bals)Vuill而致死的干燥体。僵蚕的临床
[1,2]
应用十分广泛,临床上有较好的疗效。现代药理研究表明僵蚕具有抗凝血、抗惊厥和抗[5]
炎等作用。文献报道僵蚕的主要成分为蛋白质、酶、氨基酸、草酸铵等物质,其中蛋白质含量在50%左右,并认为抗凝活性成分可能为多肽类或其它含胺基的化合物。卫功庆等用酸水解方法测得僵蚕中含有17种氨基酸,其中甘氨酸最高,其次为丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸等。笔者以前研究报道了采用薄层色谱法(TLC)和经典化学法对僵蚕提取物中蛋白质和多肽类、氨基酸、草酸铵等进行鉴别与含量测定。本文采用RP-HPLC法测定僵蚕提取物中组成蛋白质和多肽的氨基酸残基种类与含量,现报道如
[]12[8]
[7]
[6]
[7]
[3]
[4]
下。
1 仪器与试药
1.1仪器 LC-10AVPHPLC系统(日本shimadzu公司);SK3300H超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司);PB203-F电子天平(METTERTOLEDO公司)。1.2试药 制僵蚕(浙江产,购自湖南振兴中药饮片有限公司),经湖南中医学院中药鉴定室鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriL的幼虫感染白僵菌而致死的干燥体;15种氨基酸对照品(色谱纯),邻苯二甲醛(OPA,分析纯),购自Sigma公司;四氢呋喃(THF,色谱纯),购自上海太阳生物技术公司。
2 方法与结果
[8]
2.1僵蚕提取物制备方法 按文献凝胶分离样品制备,收集凝血酶时间大于100s有组份经冷冻
干燥即得。2.2对照品溶液的配制 取天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸等15种氨基酸对照品各适量,用0.1mol/LHCl溶解并稀释至50μmol/L的溶液,摇匀即得。2.3样品的水解 精密称取提取物约0.4g置于水解瓶中,加5.7mol/LHCl液1mL,抽真空后,在110℃水解24h,蒸干HCl,加甲醇1mL溶解,即得。
2.4色谱条件 色谱柱:C18(4.6×150mm,5μm);流动相:A:50mmol/LNaAc(pH6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),B:50mmol/LNaAc(pH6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),超声脱气
10min,用0.2μm滤膜过滤,梯度洗脱程序见表1;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;荧光检测器:λex:338nm,λem:425nm。
表1 氨基酸分析的梯度洗脱程序
time(min)
061628323435
A(%)958860250095
B(%)51240751001005
111111曲线
乙醇30μL。样品溶液和对照品溶液各10μL与
100μLOPA试剂反应3min,然后注入液相色谱仪,结果见图1、图2及表2。
图1 15种氨基酸对照品图
图2 僵蚕的提取物氨基酸分析图【僵蚕怎么处置】
1.天冬氨酸2.谷氨酸3.丝氨酸4.组氨酸5.甘氨酸 6.苏氨酸7.精氨酸8.丙氨酸9.酪氨酸10.蛋氨酸 11.缬氨酸12.苯丙氨酸13.异亮氨酸14.亮氨酸 15.赖氨酸
2.5OPA试剂和氨基酸的衍生化 OPA试剂10mg用0.5mL甲醇溶解,加入0.4mol/L硼酸(用
KOH调节pH至10.0)缓冲液2mL和2-巯基
表2 15种氨基酸残基分析结果(单位:mg/100mL)
氨基酸种类天冬氨酸Asp谷氨酸Glu丝氨酸Ser组氨酸His甘氨酸Gly苏氨酸Thr精氨酸Arg丙氨酸Ala
含量157.96477.6866.76116.88137.20100.36154.68313.38
占总AA%7.5222.763.185.576.544.787.3714.93
氨基酸种类酪氨酸Tyr蛋氨酸Met缬氨酸Val苯丙氨酸Phe异亮氨酸Ile亮氨酸Leu赖氨酸Lys总量
含量15.0418.00167.1241.08106.88125.28100.762099.16
占总AA%0.720.867.961.965.095.974.80100.00
3 讨论
由于样品在水解过程中色氨酸和辅氨酸残基被破坏,因而本实验未检测该两种氨基酸残基。①从表2可见,僵蚕提取物含有Asp、Glu等15种氨基酸残基,总量为2099.16mg/mL,在提取物中占、中Glu残基最高,其次为Val、Glu和Arg残基,Met和Phe残基含量均较低。②文献
[7]
报道白僵蚕
水解后含有17种氨基酸,Gly最高,其次为Ala、
Ser和Tyr,而Arg最低。本结果与其相比,提示僵蚕提取纯化后含Glu、Val、Arg等残基的蛋白As
时可致使肾血管痉挛,增加热缺血时间。笔者建议,在离断肾蒂后取出供肾时,取肾切口应相应较大,以避免切口对供肾的过度挤压。必要时可采用手助式离断肾血管取出供肾。开放或腔镜两种取肾方法相比,捐献者的安全性和供肾的质量无明显区别。
3.4免疫抑制剂的使用剂量 HLA有一半相同的兄弟姐妹和父母与子女间的移植,CSA只需是用常规剂量的下限(4mg/(kg·d)),三个月后可减为3mg/(kg·d),本组3例父供子肾移植随访5～8月,移植肾功能正常,未发生急性排斥反应。无血缘关系或HLA完全不同的夫妻间的移植CSA的用量同尸体肾移植。
3.5多排CT重建技术确定肾血管的情况 多排螺旋CT重建技术能清晰的显示双肾的形态和肾血管的情况,我院7例活体肾移植供者均利用该技术进行肾血管情况的分析,结果与术中情况完全相同。该技术无创、血管显示清晰、可在临床上推
广使用。
参 考 文 献
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[9]
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究[J].西北药学杂志,2005,
20(6)∶248
报道该僵蚕提取物中
用经典方法(凯氏定氮法)测定的蛋白质类为
53.65%,则15种氨基酸占凯氏定氮法测定的蛋白质含量的83.03%,这说明其他氨基酸或含氮物质可能存在,有待进一步研究。
参 考 文 献
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性初步研究[J].湖南中医学院学报,1992,12(3)∶37
辽宁中医杂志2010年第37卷第12期
·2421·
六种僵蚕炮制品的薄层鉴别与含量测定研究
赵
1112清，郝丽静，马晓莉，苑文英，郭
辉
1
（1．河北大学中医学院，河北保定071000；2．河北大学基础医学院，河北保定071000）
要：目的：考察不同炮制方法对僵蚕中草酸铵、槲皮素和山奈酚的含量影响。方法：采用薄层色谱法对僵蚕6种
炮制品进行薄层鉴别研究；采用高效液相色谱法测定各炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚的含量。结果：僵蚕各炮制品
摘
的薄层色谱未见明显差异，但僵蚕经过炮制后体内草酸铵含量都有不同程度的下降。其中糖麸炒僵蚕的含量最低，而麸炒僵蚕中草酸铵含量下降的最少。僵蚕经过炮制后所含槲皮素与山奈酚的含量变化不大，与生品较为接近，但姜炙僵蚕与姜麸炒僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量降低得较为明显。结论：不同炮制方法对僵蚕的化学成分含量有一定程度的影响，但影响幅度不尽相同。并且，不同的炮制方法功效各异，各有所长。为提高临床疗效和便于患者服用，可根据需要对其炮制方法灵活选择。
关键词：僵蚕；炮制品；薄层鉴别；草酸铵；槲皮素；山奈酚；含量测定
中图分类号：R285．5
文献标识码：B
文章编号：1000－1719（2010）12－2421－04
SdutyonThinLayerChromatographyDifferentiation
andDeterminationofSixKindsofPreparedBombyxBatryticatus
ZHAOQing1，HAOLi-jing1，MAXiao-li1，YUANGWen-ying2，GUOHui1
（1．TraditionaolChineseMedicineCollegeofHebeiUnivercity，Baoding071000，Hebei，China；
2．BasicMedicalCollegeofHebeiUnivercity，Baoding071000，Hebei，China）
Abstract：Objective：Toinvestigatetheeffectsofdifferentprocessingmethodsonthecontentsofammoniumoxalate，quercetinandandkaempferolinBombyxbatryticatus．Methods：Thechemicalcompositionwerediscriminatedbythinlayerchromatography，thecontentsofammoniumoxalate，quercetinandkaempferolweredeterminedbyHPLC．Results：TherewerenothingdifferentfromeachkindofprocessedBombyxbatryticatusbythinlayerchromatographydifferentiation，butthecontentsofammoniumoxalateandthecontentofstir－fryingwithweredecreased．Thecontentsofammoniumoxalateofprocessedwerelowerthanunprocessed，
branandsugarwasthelowestatall．Thecontentofammoniumoxalateofstir－fryingwithbranwashigherthanotherpreparedproducts．Thecontentsofquercetinandkaempferolinpreparedproductswereclosedtotheunprpcessed，butthecontentsofthetwocomponentsinBombyxbatryticatusweredecreasedobviouslywhichwerestir－fryingwithbranandgingeraswellasbakingwithgingerjuice．Conclusion：DifferentprocessingmethodshaddifferenteffectsonthecontentsofeffectivecomponentsofBombyxbatryticatus，anddifferentmethodshadgottendifferentfunctions．Sothedoctorsshouldchoosetheexactprocessingmethodflexibi-lybasedontheneeds．
Keywords：Bombyxbatryticatus；preparedproducts；thinlayerchromatographydifferentiation；ammoniumoxalate；quercetin；kaempferol；determination
是目前进行无机痕量分析的最有效技术之一，微波消操作简便，消解完全的特点；解处理样品具有速度快，
而电感耦合等离子体质谱法，更是具有可进行多元素同时分析，且干扰少、精密度高、线性范围宽、分析速度快优势。因此，多用于中药材中微量及有害元素分析
［2－6］
的5种有害元素的含量进行了测定，为蜈蚣商品药材
的相关研究提供了基础参考数据。
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，．．2005，22（6）：22－24．。蜈蚣中有害元素的分析未见报道，本实验结
合微波消解技术，利用ICP－MS法对蜈蚣商品药材中
收稿日期：2010－03－17
基金项目：河北省中医药管理局科学研究项目（2009151）；保定市科技
局科技支撑项目（09ZF012）；河北大学青年科研基金项目（2008Q074）
女），事中药饮片炮制工艺及炮制机理研究。
·2422·
，僵蚕又名白僵蚕，始载于《神农本草经》为临床
常用动物类中药，具有祛风解痉，活血通络，化痰散结是僵蚕抗惊之功效。虫体表面的白粉中含有草酸铵，
［1］
厥的有效成分。僵蚕破碎后可分为皮类、透明胶状物和绿褐色物质等不同部位，其中绿褐色物质为蚕食用桑叶未经消化就僵死后贮存于体内的聚合固化物，具有玻璃样光泽。由于桑叶富含黄酮类化合物，所以有文献报道僵蚕体内含有一定量的槲皮素和山奈［2］
酚。为探讨不同炮制方法对僵蚕各种成分的含量影响，今对清炒僵蚕、麸炒僵蚕、姜炙僵蚕、蜜麸炒僵蚕、糖麸炒僵蚕和姜麸炒僵蚕6种炮制品进行了薄层色谱对比研究，采用高效液相色谱法对各炮制品中草酸铵、槲皮素和山奈酚进行了含量测定研究，以探明不同炮制工艺对僵蚕各化学成分的影响，为优选炮制工艺参数和指导临床合理用药提供科学依据。11.1
仪器与试药仪器
2.1.5
辽宁中医杂志2010年第37卷第12期
糖麸炒僵蚕取红糖24g溶于热水中，加热浓
缩至30mL，放凉，淋入30g麦麸中，不断搅拌至握之成团推之即散时备用。然后将炒制容器用中火加热至所需程度，撒入含有红糖汁的麦麸，约2min后烟起，投入净僵蚕300g，不断翻炒至僵蚕表面呈金棕色，麦麸焦黑色时，取出，筛去麦麸，放凉。2.1.6
姜麸炒僵蚕取鲜姜24g榨汁后加入少许清水定容至30mL，淋入30g麦麸中，不断搅拌至握之成
团推之即散时备用。然后将炒制容器用中火加热至所需程度，撒入含有生姜汁的麦麸，约2min后烟起，投入不断翻炒至僵蚕表面呈深黄色，麦麸焦净僵蚕300g，黑色时，取出，筛去麦麸，放凉。
表1
炮制方法清炒麸炒姜炙蜜麸炒糖麸炒姜麸炒
僵蚕不同炮制工艺参数数据表
投药时锅温（℃）145185120177175175
出锅时药温（℃）10512197130128127
炒制时间（min）6.54.58.57.07.06.5
火力中火中火文火中火中火中火
UltiMate戴安UltiMate3000高效液相色谱仪，
UltiMate3000variablewavelength检测3000四元泵，
Chameleon工作站，KQ－250B型超声波清洗器（昆器，
河北红日天然气灶，圆底炒山超声仪器设备公司），
TES－1306热电偶数字温度计，JYZ－6D型九阳榨锅，
PHSJ－4A型酸度计（上海雷磁），TDL－5型低汁机，速离心机。
1.2试药
槲皮素（100081－200406）和山奈酚标准品（110861－200808）均购置于中国药品生物制品检定所。硅胶G（青岛海洋化工厂），氯仿、甲醇、乙醇、浓氨水、草酸铵、磷酸氢二铵、磷酸、氯化钙等试剂均为分析纯（天津化学试剂），自制重蒸水。僵蚕购于河北安国昌达中药饮片厂（20081123），经本院中药鉴定教研室主任崔桂华教授鉴定系蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriL.幼虫感染或人工接种白僵菌Beauveriabassiana（Bals.）Vuill而致死的干燥虫体。22.12.1.1
方法与结果
僵蚕不同炮制品的制备
2.3
僵蚕不同炮制品薄层色谱鉴别
2.3.1色谱条件层析板：取硅胶G，加5%羧甲基105℃活化1h。研匀，铺板，干燥，纤维素钠，【僵蚕怎么处置】
2.3.2药材溶液的制备分别取各种僵蚕粗粉各1g，置50mL具塞三角烧瓶中，加甲醇10mL，超声提取30min，滤过，滤液浓缩至2mL，作为对照药材溶液。2.3.3
［3］
僵蚕各炮制品薄层鉴别方法1取上述各
种药材溶液各10μL点于同一薄层板上，以氯仿－甲
醇（12∶1）为展开剂上行展开，展距16～18cm，取出晾干，在365nm紫外灯下检视，结果如图1所示。2.3.4
［4］
僵蚕各炮制品薄层鉴别方法2取上述各
种药材溶液各10μL点于同一薄层板上，以石油醚一
清炒僵蚕取净僵蚕300g，置炒制容器内，中
火加热，不断翻炒至虫体表面微微鼓起，表面略挂火
丙酮（7∶3）为展开剂上行展开，展距15～17cm，取出晾
碘蒸气显色，结果如图2所示。干，2.3.5
僵蚕各炮制品薄层鉴别方法3取上述各种药材溶液各10μL点于同一薄层板上，以丙酮－苯－
［5］
颜色加深时取出，放凉。斑，【僵蚕怎么处置】
2.1.2麸炒僵蚕先将炒制容器用中火加热至所需均匀撒入定量的麦麸，即刻烟起，随之投入净僵程度，蚕300g，不断翻炒至僵蚕表面呈黄色，麦麸呈黑色时，取出，筛去麦麸，晾凉。
2.1.3姜炙僵蚕取鲜姜30g切碎后榨汁，加少许清水定容至30mL备用。取300g净僵蚕加姜汁拌匀后，闷润，待姜汁被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出，放凉。2.1.4
蜜麸炒僵蚕取蜂蜜24g溶于热水中，加热浓缩至30mL，放凉，淋入30g麦麸中，不断搅拌至握之成
70%乙醇－浓氨水（5∶4∶2∶1）为展开剂上行展开，展距
15～17cm，取出晾干，在365nm紫外灯下检视，结果如图3所示。
团推之即散时备用。然后将炒制容器用中火加热至所
需程度，撒入含有蜜汁的麦麸，约2min后烟起，投入净
色时，取出，筛去麦麸，放凉。
辽宁中医杂志2010年第37卷第12期2.42.4.1
各炮制品中草酸铵的含量测定
［5］
·2423·
2.4.5
精密度试验一定浓度的标准品溶液，重复进
样5次，每次20μL，记录峰面积，计算RSD为0.98%。2.4.6稳定性试验取供试品溶液于室温放置，分别2、4、8、24h进样20μL，于0、记录峰面积，计算RSD为1.31%。
加样回收率试验取僵蚕干燥粉末（过20目
筛）10.00g，精密称取草酸铵约0.4g，加入其中，按“2.4.3”项下方法，除供试品溶液再稀释1倍外（即制备成100mL），同法操作制备供试品溶液，取其20μL
RSD为进样，记录峰面积，求得加样回收率为96.5%，0.86%。
样品测定分别精密称取各种样品，按
“2.4.3”项下方法，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录草酸铵的峰面积，计算含量，结果见表2。
表2
各种僵蚕炮制品草酸铵含量测定结果
峰面积22.490715.510318.537113.047916.353412.08413.3122
相对浓度（mg/mL）0.09220.06360.07600.05350.06700.04950.0546
草酸铵含量（%）9.086.237.485.396.544.905.44
样品重量（g）10.153410.207910.15509.923510.245410.093710.0339
色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶
（Diamonsil，250mm×4.6mm，5μm）；流动相为磷酸氢
pH2.50）；流速为0.5mL/min；二铵水溶液（5.0g/L，
柱温为25℃；检测波长为214nm；进样量为20μL，在该
色谱条件下草酸铵分离效果良好，色谱图见图4和图5
。
2.4.7
2.4.8
图4草酸铵标准品HPLC图
炮制品种生品僵蚕清炒僵蚕麸炒僵蚕姜炙僵蚕蜜麸炒僵蚕糖麸炒僵蚕姜麸炒僵蚕
2.4.2
标准品溶液的制备精密称取室温空气干燥至恒重的草酸铵约0.16g，平行3份，按药典方法用
KMnO4标准溶液（0.0211mol/L）测定的草酸铵含量为99.39%（RSD为0.79%）。再精密称取以上干燥至恒用流动相溶解，定容至100mL，重的草酸铵0.1506g，
摇匀，用0.45μm的微孔滤膜抽滤，滤液即为储备对照液（1.
2.52.5.1
僵蚕各炮制品中槲皮素与山奈酚的含量测定
色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶
（Diamonsil，250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－0.4%磷酸（55：45）；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为370nm；进样量为20μL。在该色谱条件下槲皮素与山奈酚的分离效果良好。其中，槲皮素的保留时间为10～11min，而山奈酚的保留时间为19～20min。色谱图见图6和图7。2.5.2
图5
僵蚕样品中草酸铵HPLC图
标准品溶液的制备分别精密量取浓度为
0.214mg/mL的槲皮素标准品溶液2.0mL和浓度为
2.4.3
供试品溶液的制备取僵蚕干燥粉末（过20
目筛）10.00g，用8倍量和5倍量水，分别于沸水浴上
30min/次，抽滤，合并滤液，用容量瓶定容为回流，
0.892mg/mL的山奈酚标准品溶液1.0mL至25mL量
用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液，其中槲瓶中，
皮素的浓度为17.12μg/mL，山奈酚的浓度为
35.68μg/mL。2.5.3
供试品溶液的制备取僵蚕干燥粉末2.0g
（过65目筛），用8倍量甲醇（内含1%盐酸）浸泡过夜后超声提取30min，滤过，残渣加入6倍量甲醇再次超
200mL。再从中精密吸取1mL于10mL试管中，在
70～80℃水浴上加热5min，滴加CaCl2试液（0.25mol/L）使CaC2O4沉淀完全，放冷，离心，弃去上清液，沉淀用流动相溶液超声溶解，定量转移于50mL容量瓶中定容，用0.45μm的微孔滤膜抽滤，即为供试品溶液。2.4.4标准曲线的制备分别精密吸取储备对照液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于10mL容量瓶中，用流动
150.6、301.2、451.8、相稀释，定容，摇匀，制成75.3、602.4μg/mL的系列对照品溶液，用0.45μm的微孔滤
膜滤过，取20μL注入色谱仪，记录峰面积。以标准品浓度（x）对峰面积（y）进行线性回归，得一元回归方程为：y=0.1032x+5.1025（r=0.996）。结果表明草酸的线性关系。
声提取30min，滤过。合并两次滤液并减压浓缩至10mL，定容，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过即得。2.5.4
标准曲线的制备分别精密吸取混合标准品
2.0、4.0、6.0、8.0mL于10mL容量瓶中，溶液1.0、以
甲醇定容，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，精密吸
取20μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，以槲皮素、山奈酚进样量为横坐标绘制标准曲线，得一元回归方程分别为y=79.34x+1.0463（r=0.9998）和y=95.972x+1.1421（r=，山0.07130.5709μg。
·2424·
2.5.5
精密度试验取一定浓度的对照品溶液，重复
进样5次，每次20μL，记录峰面积，计算RSD分别为1.15%和1.32%。2.5.6
稳定性试验取供试品溶液于室温放置，分别2、4、8、24h进样20μL，于0、记录峰面积，计算RSD分精密称取已知含量的样品各6份，分别加入槲皮素、山萘酚对照品，测定含量，结
辽宁中医杂志2010年第37卷第12期
法3的条件下均于薄层板相应的位置上显棕色斑点及
淡红色荧光斑点，但图4中，麸炒品和蜜麸炒品的荧光在上述3种方法中，僵蚕各炮制斑点较弱。由此可见，
品的薄层鉴别未见明显差异。
僵蚕中含有的草酸铵是其抗惊厥的有效成分，同时也具有一定的抗凝作用。但生品中过多的草酸铵容易引起人体血氮升高从而导致患者昏迷和抽搐，而僵蚕经过炮制后正可以适度降低草酸铵的含量。从表5中可以看出，僵蚕各炮制品中草酸铵的含量较之生品都有不同程度的下降，其中糖麸炒僵蚕的含量下降得约为生品僵蚕草酸铵含量的53.96%，姜炙最为明显，僵蚕、姜麸炒僵蚕其次，而麸炒僵蚕中草酸铵含量下降的最少。
文献报道，生品僵蚕中槲皮素的含量为0.22mg/
［2］
g，山萘酚的含量为0.64mg/g。而本实验的结果则表明生品僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量分别为38.96、9.79μg/g，仅为文献报道含量的17.7%和1.5%，并且山奈酚含量要远小于槲皮素的含量，与文献报道结果出入较大。推测是不同产地不同批次的僵蚕体内存在的未消化桑叶质与量的不同造成的。僵蚕经过炮制后所含槲皮素与山奈酚的含量变化不大，与生品较为接近，但姜炙僵蚕与姜麸炒僵蚕中槲皮素与山奈酚的含量降低得较为明显。姜的化学成分
其中辛辣成分主要主要有挥发油及辛辣成分两大类，
［7］
包括姜辣素、姜烯酚和姜酮等酚类物质，这些物质的分子结构中均含有3－甲氧基－4－羟基苯基的官能［8］
团和长短不同的烃链。而槲皮素和山奈酚均为黄酮醇类化合物，分子结构中富含性质活泼的酚羟基，因此
别为0.98%和1.29%。
2.5.7加样回收率试验
95.81%，RSD分别为果平均回收率分别为94.83%、
2.13%、2.03%。样品测定分别精密称取各种样品，按“2.5.3”项下方法制成供试品溶液，微孔滤膜滤过后，精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱峰的峰面积，计算含量，结果见表3。
表3
各种僵蚕炮制品槲皮素与山奈酚含量测定结果表（μg/g）
样品重量2.02912.04112.05032.03142.02152.01362.0716
槲皮素峰面积1.98731.59132.16460.98853.19451.66511.1987
山奈酚峰面积3.55942.85013.87691.77045.72142.98222.147
槲皮素含量38.958723.502545.619221.695932.877131.684022.2871
山奈酚含量9.79407.796310.55754.866115.80268.26935.
7863
2.5.8
炮制品种生品僵蚕清炒僵蚕麸炒僵蚕姜炙僵蚕蜜麸炒僵蚕糖麸炒僵蚕姜麸炒僵蚕
C3羰可以推论这些酚羟基可以与姜酚中的C5羟基、
基、酚羟基或姜烯酚、姜酮中的酚羟基发生反应。姜炙僵蚕和姜麸炒僵蚕都采用了姜汁作为炮制辅料，因而这两种炮制品中槲皮素和山奈酚的含量与其他炮制品相比有所降低。
不同炮制方法对僵蚕的化学成分含量有一定程度的影响，但影响幅度不尽相同。并且，不同的炮制方法
图6
槲皮素与山奈酚标准品HPLC
图
功效各异，各有所长。在实际工作中为提高僵蚕的临床
医药工作者可根据需要对其炮制方法灵活选择。疗效，
参考文献
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2005，25（1）：1－3．湖南中医学院学报，［2］王锦军，张冕，张秀梅．RP－HPLC法同时分析僵蚕中槲皮素、山J］．饲料工业，2009，30（12）：48－50．萘酚的含量［［3］张丽增，代云桃，秦雪梅，等．僵蚕薄层鉴别方法的改进［J］．中国2006，7（4）：61－62．药品标准，［4］李晓华．僵蚕质量标准规范化研究［C］．成都中医药大学2003级
2006：25－26．硕士研究生论文，
图7槲皮素与山奈酚样品HPLC图
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［J］．中国中药杂志，2001，26（11）：748－751．［8］Connell，DW，MclachlanR．NaturalpungentcompoundsⅣ．Examina-andgas［J］．，1972，67：29．
3讨论
为考察不同炮制方法中炮制辅料和炮制温度对僵
蚕化学成分种类和含量的影响，对僵蚕各炮制品进行了薄层色谱的鉴别研究。从图3中可以看出在方法1色荧光斑点；而图4和图5中，各炮制品在方法2和方
XXXX 前处理工艺规程
文件编号：ETM.PD.016
(版本号：A)
XXXX有限公司
目 录
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
产品概述 .......................................................................................................................... 错误！未定义书签。 产品处方与制法 ............................................................................................................................................. 3 物料一览表 .................................................................................................................................................... 3 生产工艺流程图 ............................................................................................................................................. 4 主要设备一览表 ............................................................................................................................................. 4 生产操作要求 ................................................................................................................................................. 4 物料平衡、物料消耗定额及技术经济指标 ..................................................................................................... 7 安全要求 ........................................................................................................................................................ 7 劳动组织与岗位定员 ...................................................................................................................................... 8
10. 生产过程中异常情况及处理 ........................................................................................................................... 8 11. 相关记录 ........................................................................................................................................................ 8 12. 修订历史 ........................................................................................................................................................ 8
1. 产品概述
通用名：XXXX 汉语拼音： 产品代码： 剂型：胶囊剂 规格：。 功能主治：。 性状：。 有效期：24个月
包装规格：12粒/板×2板 标准依据： 批准文号： 贮藏条件：。
2. 产品处方与制法
2.1 处方：（1000粒）
2.2 制法
以上七味，取三分之一XX粉碎成细粉，XXX、XXX加水提取挥发油，药渣与剩余XXX和XX、XX、XX加水煎煮二次，加水量依次为10倍、8倍，第一次煎煮1小时、第二次煎煮1小时，合并煎液，滤过，浓缩至相对密度为1.30（60℃）的清膏，加入僵蚕细粉，混匀，干燥，粉碎，总混，喷入挥发油，装入胶囊，制成1000粒，即得。 2.3 生产制法
XXXXXX
3. 物料一览表
3.1原辅料
3.2产品
4. 生产工艺流程图
5. 主要设备一览表
6. 生产操作要求
6.1 领料 6.1.1 操作间信息